Вирусологический детектив



В. Зуев, доктор медицинских наук

...Мы с вами входим в лабораторию микробиологии латентных инфекций Института эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи. Уже само название лаборатории говорит о том, что усилия ее сотрудников направлены на изучение скрытых форм инфекционного процесса. А начата работа была с изучения возможности формирования скрытой (латентной) гриппозной инфекции.
Но почему именно гриппозной? Выбор этот нельзя назвать случайным. Вирус гриппа, открытый в 1933 году, до сих пор вызывает пандемии, периодически носящие характер мировых эпидемических катастроф. Напомним, что ежегодная заболеваемость гриппом превышает заболеваемость, вызываемую всеми инфекционными агентами, вместе взятыми. Это, естественно, наносит ни с чем не сравнимый вред здоровью населения и огромный экономический ущерб народному хозяйству.
Со времени открытия вируса гриппа и до недавнего времени он рассматривался лишь как возбудитель острого инфекционного заболевания, признаки которого, к сожалению, известны почти каждому жителю нашей планеты. Да и механизм распространения вируса гриппа, казалось, не представляет большого секрета.
В течение долгого времени казалось, что основные закономерности гриппозных эпидемий вполне объяснимы. Но в этой стройной системе оставалось одно «белое пятно» - не было ответа на вопрос: куда девается и где сохраняется вирус гриппа в период между эпидемиями? Ведь грипп - заболевание сезонное!
Число необъяснимых явлений увеличивалось. Накапливалось, например, все больше сведений о вспышках гриппа среди людей, долгое время находящихся в изолированных коллективах: чабаны, зимовщики, участники экспедиций, геологи, новобранцы военных лагерей. Изолированность подобных коллективов исключала возможность контактов с больным человеком. К тому . же вспышки в таких изолированных коллективах нередко наблюдались в периоды между эпидемиями в данной стране или области.
А вот еще один интересный пример. Английские исследователи Д. Миллер и Дж. Ли подметили, что крупнейшей эпидемии в Англии в 1967-1968 годах предшествовали небольшие вспышки этой болезни на северо-западе страны, за которыми последовала длительная пауза. Но последующее развитие эпидемии характеризовалось одномоментностью охвата заболеванием сразу большого числа людей на обширных территориях.
По мнению исследователей, в период эпидемической «паузы» вирус гриппа продолжал рассеиваться и формировал латентную инфекцию у множества людей. Вот почему после изменения метеорологических условий создавалась благоприятная почва для перехода скрытой инфекции в клинически выраженную сразу у большого количества людей. Этим и объяснялся «взрывоподобный» характер эпидемии, жертвами которой тогда стали два миллиона жителей Британских островов.
Развивая эту гипотезу, Р. Хоуп-Симпсон и П. Хиггенс пошли еще дальше своих соотечественников. Оки предположили, что после каждой эпидемии гриппа остаются мощные резервуары латентной гриппозной инфекции среди населения. Постепенно это приводит к возникновению всемирного «пула» скрытой гриппозной инфекции, что, в свою очередь, создает благоприятную обстановку для новых эпидемий в результате активации такого вируса под влиянием изменившихся погодных условий (похолодание, высокая влажность).
Итак, накапливались факты, не укладывавшиеся в существовавшие представления о путях передачи ьируса гриппа; латентная гриппозная инфекция продолжала оставаться в области догадок. С какого же конца подойти к распутыванию этого клубка?
Начали с выяснения вопроса, представлявшегося главным: обладает ли вообще вирус гриппа принципиальной способностью формировать латентную инфекцию?
Поздней осенью 1968 года в лаборатории заразили вирусом гриппа первые культуры клеток. По счастливой случайности, это были клетки, не чувствительные к вирусу гриппа, то есть обычными для. таких случаев методами в них нельзя было обнаружить вирусного размножения. И вирус не вызывал разрушения таких культур.
Действительно, зараженные клетки как бы хранили гордое молчание - они размножались и не обнаруживали ни малейших признаков дегенерации. Их продолжали пересевать. Казалось бы, такая работа не сулила ничего нового. Но клетки прошли три пассажа, и в их поведении была подмечена неожиданная странность: пересевы уже нельзя было делать один раз в неделю - за этот срок клеток стало нарастать так много, что они образовывали не однослойный ковер, а многослойный пирог. К таким когда-то зараженным клеткам присмотрелись внимательно. И обнаружили, что они отличаются от контрольных (никогда не заражавшихся) явно большими размерами.
Специально проведенные опыты установили резкое повышение скорости размножения зараженных клеток и увеличение в 1,5 раза их размеров. Такие клетки уже не стоило выбрасывать - в них явно что-то происходило. Поэтому был сделан следующий шаг: клетки исследовали с помощью метода флуоресцирующих антител. После обработки этих клеток противогриппозными антителами в них наблюдалось свечение. Это означало, что в клетках находится белок (антиген) вируса гриппа. А ведь такие клетки уже полгода размножаются в лаборатории после их первоначального заражения вирусом.
Приступили к поискам вируса. Последовала полоса сплошных неудач. Шли месяцы. Казалось, жар-птица лишь оставила в клетках свое яркое светящееся флуоресцирующее перо...
Спустя еще полгода вирус гриппа был выделен из таких внешне нормальных, здоровых клеток. И хотя культура клеток - это далеко еще не организм (совсем не организм!), вирус гриппа все же продемонстрировал свою принципиальную способность поддерживать латентную форму инфекционного процесса. Теперь требовалось начать изучение всех этих процессов в условиях живого организма. Какого?
Грипп давно перестал быть только болезнью человека. От этого недуга страдают свиньи, коровы, лошади, собаки, индейки, куры, утки. А несколько лет назад вирус гриппа был выделен даже из организма кита (правда, осталось неизвестным самочувствие гиганта, поэтому до сих пор неясно, был ли он больным или латентно инфицированным). В настоящее время факты указывают на возможность широкого обмена штаммами вируса гриппа между человеком и животным, и это обстоятельство значительно осложнило и без того запутанную эпидемиологию гриппа. Таким образом, приступая к изучению возможности существования латентной гриппозной инфекции в организме, ученые располагали значительным выбором. Остановились на мышах - дешевых, распространенных и легкодоступных лабораторных животных.
Работа на мышах имела свои неоспоримые преимущества. Здесь многое уже было известно: и то, что внутриносовое заражение животных приводит к развитию у них гриппозной пневмонии, в тяжелых случаях заканчивающейся гибелью; и что вирус при этом в очень высокой концентрации накапливается в ткани легких; и что у выживших после заражения животных вирус из легких (а тем более из других органов) можно выделять максимум до двенадцатого дня от момента его введения и не позднее.
Следовательно, если у выживших после заражения животных формируется латентная гриппозная инфекция, то для ее доказательства необходимо суметь выделить вирус гриппа после двенадцатого дня. Как же практически это сделать?
Первая мысль, которая пришла в голову, состояла в следующем: конечно же, вирус не может находиться в организме в концентрациях столь высоких, как это имеет место при острой инфекции. Поэтому, чтобы извлечь его из клеток легочной ткани, ее разрушение должно быть по возможности более полным. Обычно вирус из легких (да и любых других органов) зараженных мышей извлекают растиранием этих органов со стеклянным порошком. Теперь это начали делать с электрокорундом - специальным абразивным материалом, уступающим по твердости только алмазу.
Эффективность разрушения клеток легких действительно оказалась в сто раз выше, но перси-стирующий вирус таким образом обнаружить все-таки не удалось.
Тогда заподозрили противогриппозные антитела. Через двенадцать дней после заражения они накапли-' ваются в крови в значительных количествах. Легкие - богато снабжающийся кровью орган, и при разрушении легочной ткани присутствующая в них кровь, насыщенная антителами, нейтрализует выходящий из разрушающихся клеток вирус, поэтому-то и не удается его обнаружить. Тогда, кроме тщательного разрушения, легкие предварительно освобождали от крови, промывая через сосуды солевым раствором. Но, увы, и эта процедура не помогла.
Находясь на грани отчаяния, вспомнили о клетках, вырабатывающих в каждом организме антитела. Такие антителообразующие клетки могут находиться не только в крови, но и в различных органах, особенно там, где перед этим развивался воспалительный процесс. Конечно же, у выживших мышей, перенесших несмертельную пневмонию, в легких имел место . воспалительный процесс. Воспаление прошло, а клетки могли остаться. А ведь если в процессе разрушения легочной ткани разрушить и такие клетки, то из них выйдут противогриппозные антитела, которые также нейтрализуют персистирующий вирус, и вновь ничего не будет обнаружено.
Снова опыты. Но на этот раз легкие выживших мышей спустя два месяца после заражения тщательно отмывают от крови, а в фарфоровые ступки добавляют антитела против... мышиных антител. Теперь легочную ткань можно разрушать. Полученный экстракт вводят в куриный эмбрион. И через сорок восемь часов инкубации таких эмбрионов при 37 градусах Цельсия внутри них обнаруживают инфекционный вирус гриппа!
Итак, из организма выживших после заражения, внешне совершенно здоровых мышей через два месяца выделен инфекционный вирус гриппа. Значит, у мышей все-таки формируется латентная гриппозная инфекция после перенесенного заболевания и в организме у них персистирует вирус.
Решив вопрос принципиально, стали выяснять, как долго может персистировать вирус гриппа в организме таких выживших после заражения животных. Оказалось, более трех месяцев. Много это или мало - решайте сами. Напомню лишь, что продолжительность жизни мышей составляет около двадцати четырех месяцев.
Но в природе латентные вирусные инфекции формируются не только после перенесенного заболевания. Скрытая форма инфекционного процесса может развиваться в результате иммунизации организма живым вирусом или путем вертикальной (от матери плоду) передачи вируса.
Попробуем! Мышей проиммунизировали вирусом гриппа в дозе, которая не вызывает гибели животных. Концентрация вируса в этом случае была в 100 000 раз меньшей, чем та, которую использовали в предыдущих опытах. Все мыши выглядели здоровыми. Спустя четыре недели у них в легких начали искать вирус гриппа. И нашли! Но в этом случае персистенция вируса оказалась куда короче - не более полутора месяцев.
И, наконец, последний этап этих исследований - вертикальная передача. Речь пойдет о возможности передачи вируса от самки-вирусоносителя плоду.
Этим исследованием занялась несколько лет назад сотрудница лаборатории Елена Мирчинк. Она помещала в одну клетку самцов и самок мышей, выживших после заражения большой дозой вируса гриппа. Персистенция вируса у таких выживших мышей специально проверялась в предварительных опытах. Позднее беременных самок отсаживали, и у родившихся мышат в двухнедельном возрасте начали исследовать кровь и внутренние органы в надежде обнаружить там вирус гриппа. Я не оговорился, употребив выражение «в надежде», потому что надежда действительно казалась минимальной: во-первых, у самих родителей персистирующий вирус определялся в очень низких концентрациях, а, во-вторых, родившиеся мышата выглядели внешне совершенно здоровыми. Но... у них в организме присутствовал инфекционный вирус гриппа. Где? В крови, легких, печени, селезенке, почках и даже в головном мозге (!).
Для того чтобы оценить в полной мере всю неожиданность находки, напоминаю: в организме взрослых мышей-вирусоносителей (а стало быть, и родителей) персистирующий вирус обнаруживается только в легких, притом в очень низких концентрациях, и никогда - в крови или других органах. Мышата, которых получила в своих опытах Е. П. Мир-чинк, казалось, были нафаршированы вирусом гриппа. Так, например, в легких у них вирус определялся в количествах, в тысячу раз превышавших его концентрацию у родителей!
Для проверки этого результата поставили специальный опыт «перекрестной подсадки»: от самки-вирусоносителя мышат сразу после рождения пересаживали к нормальной (контрольной) самке, и, наоборот, нормальных мышат (родившихся от контрольной самки) пересаживали к самке-вирусоносителю. Вне зависимости от кормящей матери вирус обнаруживали только в организме мышат, родившихся от самки-вирусоносителя. Значит, вертикальная передача вируса гриппа состоялась!
Но самая главная находка ждала нас впереди.
Обнаружение у мышат, родившихся от самок-вирусоносителей, повышенных концентраций инфекционного вируса, да еще абсолютно во всех органах, конечно же, обескураживало. Что касается Е. П. Мирчинк, то ее удивление граничило с возмущением (как будто вирус просто не имел права на персистенцию в столь высоких титрах, да еще в столь широких масштабах). Не скрою, добытые факты смутили и автора этих строк.
Наши мышата после рождения выглядели внешне здоровыми и подвижными. Это благополучие настораживало. Именно поэтому я попросил Е. П. Мирчинк отсадить несколько мышат и понаблюдать за ними.
Отсаженные зверьки не вызывали сомнений и на следующий день, и через неделю. Они сидят уже десять дней... Но вот миновали две недели, и у некоторых из них начали появляться признаки отставания в росте. Сначала незначительно, а затем все заметнее такие мышата отставали от сверстников. Братья и сестры спустя два месяца весили по пятнадцати-шестнадцати граммов, а отстающие в росте едва тянули на пять. К признаку отставания в росте присоединились симптомы нарушения координации движений, походки. Появились признаки так называемой «утиной» походки. Такие животные отличались выраженным истощением, и между вторым и третьим месяцами жизни они погибали.
Вскоре опыты по вертикальной передаче персистирующего вируса гриппа поставили на мышах другой породы - с черной окраской шерсти.
У черных мышат, родившихся от самок-вирусоносителей, в организме также персистировал вирус гриппа. У части их потомства тоже наблюдалось развитие медленно прогрессирующего заболевания с резким отставанием в росте, нарушениями походки, координации движений, истощением. Эти мыши также не доживали до трехмесячного возраста.
Между прочим, иногда мышата, рожденные от черных самок-вирусоносителей, отличались неожиданным дефектом - кожа шеи, спины и верхней части лапок была лишена у них волосяного покрова. Таких мышат условно называли «голые». Условно потому, что вскоре некоторые из таких мышат начинали зарастать шерстью и в конце концов их уже нельзя было отличить от обычных животных. Те же из «голых» мышат, которые обнаруживали признаки отставания в росте, нарушения походки и координации движений, шерстью не зарастали и погибали, не дожив до трех месяцев.
Естественно, возникал вопрос: если вертикальная передача вируса гриппа легко осуществляется от самок-вирусоносителей и среди родившегося потомства в результате этого может развиваться медленно прогрессирующее заболевание со смертельным исходом, то нельзя ли наблюдать такое же заболевание у потомства, которое родилось от самок, заражаемых вирусом гриппа во время беременности?
Сказано - сделано! Этому способствовал и чисто психологический фактор. До последнего дня сотрудники нашей лаборатории, да и визитеры из других, дивились картине, которую может вызывать вирус гриппа в организме мышей, зараженных в утробе матери. То рождаются «карлики» (так Е. П. Мирчинк окрестила отстающих в росте), то «голые» (этот ярлык был дан ею мышам с дефектами волосяного покрова). Уж больно хороши были результаты, чтобы в них сразу поверить.
И исследовательница решается испытать судьбу еще раз: несколько белых и несколько черных самок мышей во время беременности она заражает вирусом гриппа. Ждем... Родилось потомство.
Итак, теперь можно немного и успокоиться - все-таки и «голые» и «карлики» рождаются под влиянием вируса гриппа. А почему они становятся такими? Короче, что же происходит у них в организме?
На этот вопрос исчерпывающий ответ дала А. М. Харитонова - опытный патоморфолог, испытавшая большие волнения в связи с этими маленькими мышатами. А у мышат в организме происходили поистине удивительные вещи.
Прежде всего поражало, что в зараженном (хотя и внутриутробно, но все же зараженном!) вирусом гриппа организме «карликов» полностью отсутствовали признаки воспаления. Зато ярко были выражены признаки дегенерации. Они наблюдались в иммунных органах, в эндокринной системе, а самое главное - в центральной нервной системе, где, кроме разрушения нервных клеток, А. М. Харитонова обнаружила и спонгиоз. Да, тот самый спонгиоз - губкообразное состояние, которое было характерным для куру, болезни Крейтцфельда - Якоба, скрепи, трансмиссионной энцефалопатии норок и амиотрофического лейкоспонгиоза. Так вот, спонгиоз у наших «карликов» тоже обнаруживался в белом веществе головного мозга, что, к нашей великой радости, и было подтверждено ведущим патоморфологом нашей страны, директором Научно-исследовательского института морфологии человека профессором А. П. Авцыным.
Итак, круг замкнулся: в результате внутриутробного заражения мышат вирусом гриппа у них в организме развивается медленно прогрессирующее тяжелое заболевание, характеризующееся отставанием в росте, нарушением координации движений, походки, развитием кахексии; заболевание всегда заканчивается смертью животных. Поражения внутренних органов носят первично-дегенеративный характер и выражаются патологическими изменениями иммунокомпетентных органов эндокринной системы и особенно центральной нервной .системы с признаками выпадения нервных клеток и развитием спонгиоза в белом мозговом веществе.
Отсюда вывод - вирус гриппа в результате заражения плода вызывает в организме потомства мышей развитие медленной формы инфекции.
Сегодня мы уже знаем и некоторые механизмы медленной гриппозной инфекции у мышей. Главный из них - резко выраженная иммунодепрессия в организме таких «карликов» и формирование иммунологической толерантности, то есть нечувствительности к вирусу гриппа. Это, видимо, и позволяет вирусу успешно размножаться и персистировать в столь значительных титрах. Вместе с тем сегодня мы еще не можем в полной мере говорить о механизме повреждающего действия вируса на центральную нервную систему, как не можем ответить на вопрос: каким образом у «карликов» развивается спонгиоз?
Теперь подведем итоги.
Хотя в этой истории речь идет о медленной вирусной инфекции мышей, но вызывает-то ее вирус гриппа! Тот самый вирус гриппа, которому доступны практически все уголки земного шара (и даже его подводная часть - вспомним про кита). К этому надо добавить, что несколько лет назад в Институте эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи Р. А. Канторович в результате эпидемиологических исследований выявил возможность нарушений развития у детей, родившихся от матерей, которые в период беременности болели гриппом.
Пора задавать главный вопрос: что знаменуют собой опыты по воспроизведению медленной гриппозной инфекции у мышей? Сегодня они уже имеют практическое значение. Совместные исследования нашей лаборатории с рядом клиник Москвы и других городов направлены на поиски медленной гриппозной инфекции у детей и взрослых там, где можно было бы предполагать грипп у матери во время беременности, либо тяжелый грипп у взрослого и развитие вскоре после этого какого-либо прогрессирующего неврологического заболевания. Эта работа началась вместе с К. А. Семеновой - директором Всесоюзного центра по реабилитации детей, страдающих параличами, И. А. Завалишиным - заведующим отделением нейроинфекций Научно-исследовательского института неврологии, А. М. Шевченко - доцентом кафедры детской неврологии Минского государственного института усовершенствования врачей. Однако эксперименты на животных продолжаются. Ведь всякое серьезное исследование гораздо больше вопросов ставит, чем решает. А решать эти все новые и новые вопросы придется прежде всего в лабораторных условиях, за лабораторным столом, на лабораторных животных. И мы помним: в каком бы направлении мы ни продолжали наши дальнейшие поиски, нам всегда в первую очередь придется искать главный процесс - персистенцию вируса в организме.